分 光 光 度 計 之 校 正

雖然隨著科技的進步，臨床實驗室中檢驗儀器層出不窮，然而分光計 (Spectrometer) 及分光光度計 (Spectrophotometer) 依舊是扮演著重要的角色。因此分光光度計功能的適當維護便成為測定結果準確的先決條件，尤其在酵素活性的測定，或無法以標準曲線 (Standard Curve) 對照的檢驗，更需嚴格要求定期檢查分光光度計的功能。藉著定期檢查校正，能及早發現儀器功能的衰退而不致影響分析結果。這些定期檢查至少須包括：長的校正，檢測器反應的線性檢查 (Detection Linearity) 及吸光度的準確度。

一、波長的準確度

分光光度計測量原理所依照的 Beer's law (A=abc)，通常是在呈色物的吸收高峰頂的波長來測定的。由於在吸收高峰斜坡測定的吸光度誤差較在吸收高峰頂測定的吸光度誤差為大，因此波長的改變對吸光度有相當的影響。

校正原理可利用具有強而特定線性光譜之光源如汞燈、氫燈和重氫燈，來校正由分光光度計通過單色器 (Monochromator) 的波長；或利用稀土元素 Holmium oxide 或 Didymium 製成的濾片 (Holmium oxide glass) 或標準液體溶液 (National Bureau of standards (NBS), certificate. SRM 2034)，有多處強吸收高峰波長來校正波長。實驗室中以 Holmium oxide solution wavelength standard 校正方法，無論在操作設備及標準物質保存方面都較為恰當。

 1、校正頻率：每 3 個月一次。

2、校正方法： 

(1) 溫熱待校正的分光光度計至少 30 分鐘。
(2) 小心插入 SRM 2034 standard cuvette (4% Holmium oxide in 10% HClO₄) or Holmium oxide glass。
(3) 由於吸光度 (Absorbance) 較不易偵測高峰波長，所以選擇穿透度 (Transmittance)。
(4) 選擇分光光度計的 bandwidth ≦ 3nm。
(5) 波長高至低 (或由低至高) 慢慢掃描 (見圖一、二)。

3、校正結果：

(1) 以 SRM 2034 standard cuvette (4% Holmium oxide in 10% HClO4) 校正：在 200nm - 650nm 之中會出現 13 或 14 個高峰 (見表一 )。當 bandwidth 小於 3nm，波長誤差在 0.5nm 則為準確。
(2) 以 Holmium oxide glass filter 校正：在 200nm - 650nm 之中會出現 10 個高峰 (見表二)。當 bandwidth 小於 3nm，波長誤差在 0.5nm 則為準確。

4、不準確時處理方法：請廠商儀器工程師來維修。

二、吸光度之校正

當進行分析檢查如果不用化學性標準物，其吸光度之準確便成為分析時直接的依據，而影響吸光度差異，主要有波長、迷光 (stray light)、光源老化以及波寬 (bandwidth)，常使用標準濾鏡 (如 NIST SRM 930) 或是配製標準溶液 (如 potassium dichromate、cobalt ammonium sulfate、potassium nitrate) 作為校正吸光度之方法。其中 potassium dichromate solution 是使用最多的一個方法。

1、校正頻率：每3個月一次。

2、藥品 (acid potassium dichromate solution) 配製 ： 

(1) 實驗進行的前一天，取多於所需使用量的 potassium dichromate (NIST SRM 935a)，放入 105℃ 烘箱中，烘乾12小時後取出置於乾燥箱內冷卻。
(2) 從乾燥箱中取出 potassium dichromate ，分別精確稱取 20mg、 40mg、 60mg、80mg 及 100mg 。
(3) 秤空的 1公升體積瓶或燒杯，重量歸零。
(4) 於體積瓶或燒杯中倒入剛才所秤取之 20mg potassium dichromate後，慢慢加入 0.001N HClO₄ Solution (in H2O)，直到 1kg (±0.01g)。依相同步驟完成其他濃度溶液的配製。
(5) 混合均勻，放入棕色容器，避光保存並且於當天完成校正工作。

3、校正方法：

(1) 實驗進行的前一天，需先將實驗中欲使用之石英 cuvette 依序浸置於 36N、24N、 12N、 6N 的 sufuric acid  各 1-2 小時後，再以蒸餾水沖洗 cuvette 後慢慢陰乾。
(2) 溫熱待校正的分光光度計至少 30 分鐘。
(3) 以拭鏡紙擦拭 cuvette 後，慢慢插入 cell holder 中 (一直到校正完成後，才能再取出或移動)。
(4) 依 (表三) 選擇波長及波寬，並記錄校正時的室溫 (t)。
(5) 以玻璃製吸管取 0.001N HClO₄ 沖洗 cuvette 5 次，第 6 次放入後立即加蓋，歸零。
(6) 依 (表三)用同樣方法，分別吸取不同濃度之 potassium dichromate 測定各濃度下之吸光度。
(7) 測得之吸光度 (A) 代入ε(t)= A/b*c，並依 (表四) 調整溫度至 ε(23.5)℃ 。

4、判別：

(1) 若 bandwidth 與 (表三) 相同，則以在 (表三) 中所列 ε(23.5) uncertainty 範圍為準確吸光度。
(2) bandwidth = 5- 8 nm 則 ε(23.5) 誤差 < 3% 則可接受。

5、不準確時處理方式：

(1) 檢查溶液配製是否有誤
(2) 檢查 cuvette 是否乾淨或放置不當
(3) 儀器是否加蓋緊密
(4) 檢查 bandwidth 
(5) 校正波長
(6) 換 Lamp source
(7) 若檢查以上因素仍無法改善，則請廠商工程師維修

三、檢測器 (Detector) 的線性反應

一台功能正常之分光光度計其被吸收的輻射能量與儀器讀出顯示之間必須是呈線性關係。而此線性關係是儀器分析準確與否的先決條件。影響線性的因素，除操作人為錯誤外 (稀釋錯誤)，即為接受器損壞、迷光存在或與 bandwidth 有關。最常用來檢查線性的方法，是使用符合 Beer's law 的各種吸光物溶液來測定。如 Oxyhemoglobin (415nm), P-nitrophenol (405nm), Cobalt ammonium sulfate (512nm), Acid potassium dichromate solution (345nm) 等稀薄溶液。其中 potassium dichromate solution 是使用最多的一個方法。

1、校正頻率：每 3個月一次。

2、藥品 (acid potassium dichromate solution) 配製： 

(1) 從乾燥箱中取出 potassium dichromate (NBS SRM 935a)
(2) 分別精確稱取 20mg、 40mg、 60mg、80mg 及 100mg 的 potassium dichromate。
(3) 秤空的 1公升體積瓶或燒杯，重量歸零。
(4) 於體積瓶或燒杯中倒入剛才所秤取之 20mg potassium dichromate 後，慢慢加入 0.001N HClO₄ Solution (in H₂O)，直到 1kg (±0.01g)。依相同步驟完成其他濃度溶液的配製。
(5) 混合均勻，放入棕色容器，避光保存並且於當天完成校正工作。

3、校正方法 ：

(1) 實驗進行的前一天，需先將實驗中欲使用之石英 cuvette 依序浸置於 36N、24N、 12N、 6N 的 sufuric acid  各 1-2 小時後，再以蒸餾水沖洗 cuvette 後慢慢陰乾。
(2) 溫熱待校正的分光光度計至少 30 分鐘。
(3) 以拭鏡紙擦拭 cuvette 後，慢慢插入 cell holder 中 (一直到校正完成後，才能再取出或移動)。
(4) 依 (表三) 選擇波長及波寬，並記錄校正時的室溫 (t)。
(5) 以玻璃製吸管取 0.001N HClO₄ 沖洗 cuvette 5 次，第 6 次放入後立即加蓋，歸零。
(6) 依 (表三) 用同樣方法，分別吸取不同濃度之 potassium dichromate 測定各濃度下之吸光度。
(7) 測得之吸光度 (A) 代入 ε(t)= A/b*c，並依 (表四) 調整溫度至 ε(23.5)℃ 。

4、校正結果 ：  r> 0.9 則可接受。(見範例)

5、不準確時處理方法 ：

(1) 檢查稀釋時是否配製錯誤。
(2) 檢查 cuvette holder 是否蓋緊， cuvette 是否乾淨或放置不當。
(3) 檢查 bandwidth 是否太大。
(4) 若以上 3 項檢查皆無法改善線性情況，則請廠商儀器工程師來維修檢查是否為接受器損壞。

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